渐进式流式细胞术实验教学的实践与思考(2)
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参见附件。
2.3 对照样本的设计
流式细胞术中对照的设计通常包括空白对照、同型对照、单阳性对照、生物样本对照等。空白对照是指单细胞悬液，除了没有加荧光试剂其余都是平行操作，空白对照的作用是用来确定细胞的基础信号，查看有没有背景荧光。某些细胞含有自发荧光蛋白，对于这种样本我们选择的荧光抗体应当避开这个荧光，避免假阳性。同型对照的目的是在空白对照的基础上进一步确定阴性和阳性细胞群体的分界线。单阳性对照是多色荧光同时检测时，只加了其中某一种荧光抗体的对照，目的是用来调节荧光补偿的。多色荧光同时检测，荧光补偿是个难点，补偿不好会导致荧光泄露到其他检测通道中，导致该通道的假阳性率增加。试剂公司有相应的补偿微球提供4种及以上的多色检测，我们建议使用补偿微球，使用相应的配套软件来设置仪器条件，通常都能得到较好的补偿效果。需要注意的是，微球虽然可以模拟细胞和荧光抗体结合，但是由于颗粒大小、表面褶皱程度和胞内密度都和真实的细胞有较大差别，所以使用微球设置好检测条件后还需用生物样本加以验证。
特别需要提到的是FMO对照(荧光扣除对照)，FMO对照是多色荧光染色时确定门边界的最佳选择，且可用于补偿调节。所谓FMO对照，就是从染色的方案里面，去掉所要分析的那个指标，例如我们要分析FITC通道的荧光表达率，那么就要从组合中去掉FITC标记的抗体。图3就显示了未染色标本或同型对照均无法正确设置设门边界，而FMO对照可以。图4更加显示了当补偿未调节到位时，FMO依然可以做到正确设门[4-7]。
图3 同型对照和FMO对照设门对比
图4 补偿不足情况下同型对照和FMO对照设门对比
同型对照无法提供设门参照 ......
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