白藜芦醇对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制作用与PI3K—Akt信号通路的关系(2)
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2.6 心肌组织Bcl2，Bax蛋白表达的免疫组化测定 每一标本取2个不同部位的切片各2张，采用链酶亲和素生物素酶复合物(strept avidinbiotin compiex，SABC)免疫组化检测Bcl2，Bax蛋白的表达。主要流程如下：切片脱蜡入水，1%过氧化氢封闭POD 10 min，加山羊血清封闭，加Bcl2，Bax蛋白的抗体，4 ℃过夜，滴加小鼠抗地高新，再滴加生物素化养抗小鼠IgG，37 ℃ 30 min，加SABC，用DAB显色、苏木素复染、水洗、封片、镜检。阴性对照不加抗体，阳性对照用已知阳性片，阳性判断标准：以细胞浆着棕黄色为阳性，用计算机图像处理系统，每次随机选10个视野，测定细胞阳性染色的A与阳性细胞百分比，计算蛋白阳性表达指数(posiive expression index，PEI)，PEI=A×阳性细胞百分比×100，并计算Bax和Bcl2的比值。
2.7 Western blot测定Akt及pAkt的蛋白表达 左心室心肌的缺血区，置于液氮中冻存后转至-70 ℃存放。称取冻存心肌样品0.1 mg，冰浴，加入500 μL组织裂解液，冰浴匀浆，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清50 μL应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。余下上清加入4×loading buffer，封闭后100 ℃水浴10 min，-70 ℃保存。以每个样品的总蛋白为20 μg上样，进行SDSPAGE凝胶电泳(浓缩胶为5%，分离胶为12%，120 V/140 V)，BioBad干转仪(≤90 mA)转膜至PVDF，2%脱脂奶粉封1 h，一抗体封闭4 ℃过夜。PBST(PBS+聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯即吐温20，1/1 000)洗膜15 min×3次；二抗(1∶4 000)37 ℃孵育1 h(羊抗兔) ......
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